FRET（熒光共振能量轉移）

熒光共振能量轉移 (FRET) 是一種在分子尺度上表征距離相關(guan) 相互作用的強大技術。它是為(wei) 數不多的能夠測量體(ti) 內(nei) 和體(ti) 外分子間和分子內(nei) 距離相互作用的工具之一. FRET 涉及通過其吸收光譜內(nei) 的入射光激發供體(ti) 熒光團。這種輻射吸收將供體(ti) 熒光團提升到更高能量的激發態，該激發態通常會(hui) 以特征發射光譜輻射衰減（返回基態）。如果另一個(ge) 熒光團分子（受體(ti) ）存在於(yu) 供體(ti) 附近，其能量狀態的特征是吸收光譜與(yu) 供體(ti) 的發射光譜重疊，則供體(ti) 和受體(ti) 之間存在非輻射能量轉移的可能性。圖1顯示了青色熒光蛋白（CFP）發射光譜和黃色熒光蛋白（YFP）吸收光譜的重疊；這對支持強大的 FRET 相互作用。

圖 1：CFP（供體(ti) ）和 YFP（受體(ti) ）吸收和發射光譜。

CFP 發射和 YFP 吸收（陰影區域）之間的重疊導致有效的 FRET 相互作用。

***能量轉移由供體(ti) 和受體(ti) 熒光團分子之間的偶極-偶極相互作用（範德華力）介導，其變化為(wei) 兩(liang) 個(ge) 分子之間距離的倒數 6 次方。從(cong) 供體(ti) 到受體(ti) 的能量轉移速率大約為(wei)  k_F     k_F~k_D(r₀/r)⁶

其中 k_D是供體(ti) 熒光團的輻射衰減率，或在沒有受體(ti) 熒光團的情況下熒光發射壽命的倒數（通常為(wei) 1 – 50 ns），r 是兩(liang) 個(ge) 分子之間的距離， r₀
是“"Förster距離”，表征能量傳(chuan) 輸的 50% 效率點。FRET 適用於(yu) 測量 FRET is suited to measuring changes in Förster 距離數量級的距離變化，通常為(wei) 20 到 90 Å.

在能量從(cong) 供體(ti) 轉移到受體(ti) 後，受體(ti) 熒光團被激發到其熒光發射狀態。因為(wei) 從(cong) 受體(ti) 觀察到的熒光發射速率受從(cong) 供體(ti) 到受體(ti) 的能量轉移的速率限製，所以 FRET 發射的定量測量可以使用上述方程提供距離的推斷測量。準確的 FRET 測定通常涉及比較有和沒有受體(ti) 存在的樣品中的供體(ti) 和供體(ti) -受體(ti) 熒光發射強度。比率測量是必要的，因為(wei) 如圖 1 所示，供體(ti) 和受體(ti) 發射光譜之間通常存在重疊，因此，很難通過單次測量準確確定使用受體(ti) 發射濾光片測量的熒光的哪一部分僅(jin) 來自受體(ti) 。熒光壽命測量為(wei) 能量轉移率提供更直接的結果，不易受濃度變化的影響，並且可以使用時域或相位調製壽命測量技術進行。 

FRET 應用通常以非常低的分子熒光團濃度為(wei) 特征。使用精心優(you) 化的濾光片對於(yu) 檢測微弱的熒光發射信號至關(guan) 重要。Semrock BrightLine® 熒光濾光片提供盡可能高的透射率，以最/大化 FRET 發射信號，以及精心優(you) 化的透射通帶深度阻擋，以實現最大可能的信號背景比（最高對比度）。

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圖 2：用於(yu) 定量測量供體(ti) 發射的 CFP 激發片、二向色和發射片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）

圖 3：帶有 YFP 發射濾光片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）的CFP 激發片和二向色濾光片，用於(yu) 受體(ti) 發射的定量測量。

可以使用兩(liang) 個(ge) 不同的濾光片組（立方體(ti) ）依次進行這兩(liang) 個(ge) 測量，其中每個(ge) 濾光片組（立方體(ti) ）具有相同的激發濾光片和二向色濾光片，但發射濾光片不同。不推薦這種方法，因為(wei) 濾光片立方體(ti) 之間的像素偏移會(hui) 使測量結果失真，並且更換濾光片立方體(ti) 需要相對較長的時間並導致樣品振動，從(cong) 而影響感興(xing) 趣分子之間的距離。相反，建議使用更快速、低振動的濾光片切換或真正同時檢測供體(ti) 和受體(ti) 發射，尤其是在對移動的活細胞樣本執行 FRET 時。對於(yu) 那些選擇使用兩(liang) 個(ge) 單獨的濾光片立方體(ti) 的人來說，選擇旨在
消除像素偏移的濾光片組很重要 以獲得最準確的測量值。

使用發射濾光輪可以實現快速、低振動的濾光片更換。這是用於(yu) 寬視場 FRET 測量的最常見的顯微鏡配置。一些研究人員更喜歡使用雙濾光片轉輪係統（一個(ge) 用於(yu) 激發片，一個(ge) 用於(yu) 發射片）的靈活性，盡管這種係統在軟件控製方麵更昂貴且更複雜。對於(yu) 雙濾光片轉輪係統，最/好/的濾光片組選擇是 Sedat 多波段組。最後，還可以使用兩(liang) 個(ge) 攝像頭同時檢測供體(ti) 和受體(ti) 發射通道。一些製造商為(wei) 此應用製造顯微鏡附件。除了標準的 FRET 濾光片組外，還需要一個(ge) 額外的二向色分束鏡來分隔附件中的兩(liang) 個(ge) 發射路徑。

熒光濾光片簡介

一個(ge) 分子吸收其吸收譜帶波長範圍（即吸收光譜）內(nei) 的光，然後幾乎瞬間發出較長的、位於(yu) 其發射譜帶波長範圍（即發射光譜）內(nei) 的光，此時，就會(hui) 發生光學熒光。為(wei) 了達到分析的目的，強的熒光分子，亦被稱為(wei) 熒光團、熒光染料，專(zhuan) 門用於(yu) 連接到生物分子或其他感興(xing) 趣的目標，用於(yu) 鑒定、定量、甚至實時觀察物質的生物和化學活性。熒光染料因為(wei) 具有*的靈敏度、高特異性和簡單性，被廣泛應用於(yu) 生物技術和分析檢測中。大多數熒光儀(yi) 器，包括熒光顯微鏡，都是基於(yu) 光學濾光片。

一個(ge) 典型的係統有三個(ge) 基本的濾光片組成：激發濾光片（或吸收濾光片），二向色鏡分束鏡（或二向分色鏡）和發射濾光片（或阻擋濾光片）。激發濾光片通常是一個(ge) 帶通濾光片，它隻透過熒光染料的吸收波長，從(cong) 而最大限度地減少熒光的其他來源的激發光和阻擋熒光發射帶內(nei) 的激發光。二向色鏡分束鏡是一種邊緣濾光片，用於(yu) 斜角入射 （通常是 45 °），以有效地反射激發波段的光和透射發射波段的光。Semrock 發射濾光片通常是一個(ge) 帶通濾光片，僅(jin) 透過熒光染料的發射波長，並阻擋這個(ge) 波段之外的所有不需要的光 - 尤其是激發光。通過濾光片阻擋不需要的激發能量（包括紫外和紅外）或樣品和係統的自發熒光，就可以得到具有黑暗背景的熒光圖像。

我們(men) 可以通過選擇適當的光學濾光片，組成一個(ge) 濾光片組，用於(yu) 觀察熒光或者對熒光進行成像，這樣就可以達到使一個(ge) 給定的熒光染料可視化的目的。因為(wei) 不同熒光染料的激發光譜和發射光譜不同，濾光片組需要優(you) 化，才可以用於(yu) 不同熒光染料的同時成像。在不同的實驗條件下使用同一個(ge) 熒光染料時，濾光片組也需要優(you) 化。